原代细胞转染的实验操作要注意的事项

　　原代细胞（primaryculturecell）是指从机体取出后立即培养的细胞。有人把培养的第1代细胞与传10代以内的细胞统称为原代细胞培养。原代细胞不仅广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究，如蛋白质组学、基因组学、细胞株（系）研究、DNA，RNA和遗传学研究等，还可应用于当今热门的生物医药产业如药物筛选、药物代谢和毒理研究、癌症药物的研究等。

　　细胞转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。

　　原代细胞细胞转染的实验操作要注意的事项：

　　1.转染试剂的准备

　　①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。

　　②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。

　　2.选择合适的混合比例(1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。

　　3.将混合液在室温放置10―15分钟。

　　4.吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。

　　5.加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。

　　6.到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入*培养基继续培养24－48小时。

　　三、第二次细胞传代

　　1.在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。

　　2.再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。

　　3.在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。